原标题：都正干货 | 杂化颗粒色谱柱的前世今生
色谱柱的发展，经历了从不定型硅胶到高纯球型硅胶、从低pH条件下不 稳定到稳定的过程。但硅胶在高pH条件下极度不稳定的问题，始终没有很好的解决方案，直到杂化颗粒的诞生。
杂化颗粒集合了有机和无机填料的优点，既具有纯硅胶填料的高柱效、高机械强度及保留稳定性能，又具有聚合物填料的宽pH范围稳定性和抑制硅醇基的酸性的特性，使其在碱性流动相中也能游刃有余。
对于资深的色谱工作者来说，你的实验室可能没用过CSH色谱柱，但一定会常备XBridge色谱柱，今天我们就来聊一聊杂化颗粒技术的前世今生。
01 第一代杂化颗粒技术：甲基杂化颗粒技术
有机-无机杂化颗粒同时存在有机成分的硅氧烷和无机成分硅胶，早在1992年之前就已经有文献报导了杂化颗粒在HPLC上的应用。
在Unger、Becker和Roumeliotis所做的重大研究成果的基础上，来自Waters的一个研究团队改良并经由四乙氧基硅烷（TEOS）和甲基三乙氧基硅烷合成了杂化颗粒，然后将这些合成的颗粒键合形成C18杂化颗粒，其反应过程如Figure1。
与相同键合相的硅胶颗粒相比，这些杂化颗粒在碱性流动相中表现出显著的稳定性，随后，基于杂化颗粒的色谱柱系列于1999年面世。这就是第一代杂化颗粒色谱柱：XTerra系列甲基杂化色谱柱。
与传统硅胶颗粒色谱柱相比，甲基杂化颗粒色谱柱具有耐受碱性流动相的特点。众所周知，传统C18硅胶颗粒色谱柱推荐的流动相最高pH为8，是因为在高pH条件下，硅胶填料开始溶解，键合相也会水解（反应机理为：在碱性条件下，OH-亲核进攻硅胶基质，发生亲核取代反应，导致硅胶溶解及键合相的水解），最终导致柱效下降。而甲基杂化颗粒因嵌入硅甲基，亲核取代反应放缓，颗粒表面溶解速度明显放缓，故色谱柱寿命大大延长。
杂化颗粒的第二个优点是对碱性分析物峰形的改善。传统的C18硅胶色谱柱在分析碱性化合物时，峰形有时候会很糟糕，是因为硅醇基与碱性化合物存在离子交换作用，导致拖尾，虽然一些色谱柱采用封端这一方法来改善拖尾，但是封端不可能完全进行，还是会有残留硅醇基，拖尾在所难免。而甲基杂化颗粒在合成之时就引入硅甲基，从根源上减少了硅醇基，所以甲基杂化颗粒酸性的降低使其在宽pH范围内为碱性化合物带来了对称的峰形。在方法开发的流动相pH优化阶段，甲基杂化颗粒色谱柱可为不同pKa值酸性和碱性的混合分析物的分离提供了更宽的选择面，如Figure2所示。
杂化颗粒的第三个优点是对碱性分析物柱容量的改善。有文献报导，当缓冲盐流动相的pH由3.75提高到10.0时，杂化颗粒色谱柱可以使一些碱性分析物的柱容量提高20倍或更高。在低pH条件时，碱性分析物处于质子化的状态，离子间的相互排斥影响其与固定相的吸附，所以对碱性分析物来说，柱容量有限。而杂化颗粒色谱柱由于能够正常的使用碱性流动相，由此能大大的提升柱容量，这对碱性分析物的色谱制备具有重大意义。
随着，2.5um粒径或更小的填料以及UHPLC的出现，色谱分析进入了快速分离的阶段，甲基杂化颗粒色谱柱面世之后，也被应用于快速分离，但是甲基杂化颗粒色谱柱在面对系统背压超过6000psi时，就显得有些力不从心，所以科学家也在继续研究新一代杂化颗粒。
02 第二代杂化颗粒技术：亚乙基桥杂化颗粒（BEH）技术
对更高强度杂化颗粒的需求促进了第二代杂化颗粒技术的开发。1995年，用由有机官能团连接两个或两个以上硅原子的原料合成了新一代杂化颗粒，其合成过程如Figure3所示，这些含有亚乙基桥基团的杂化颗粒表现出卓越的机械强度，同时也提高了在更高的pH下的稳定性。
与第一代杂化颗粒相比，须同时断裂六个键(甲基杂化颗粒需同时断裂四个键)才可以去除经亚乙基桥键连接的两个硅单元(该过程极难发生)，而且填料基体溶解所产生的有机硅离子在流动相中的溶解度较低，因此容易累积在填料微孔表面，有时可能会重新连接回颗粒表面，具有所谓的“自我修复”机制，因此，填料表面腐蚀的速度大大延缓了。2005年，基于第二代杂化颗粒的色谱柱系列面世，这就是XBridge BEH系列色谱柱。
第二代杂化颗粒色谱柱拥有更广泛的应用场景范围，包括了小分子到生物大分子的分离，并且可以耐受高温。如Figure4所示，使用Acquity BEH C18（1.7 µm，2.1mm×50mm）色谱柱分离一系列寡核苷酸，在10min中内能轻松实现基线分离。此外，第二代杂化颗粒色谱柱也可用于在亲水作用色谱（HILIC）上使用，也有不错的效果。据文献报导，甚至在高温碱性条件下（90℃，pH 10.3），1.7µm 第二代杂化颗粒酰胺柱历经2000余次的食品样品进样，依然保持卓越的保留稳定性。
03 第三代杂化颗粒技术：CSH表面带电杂化颗粒技术
通过在第二代杂化颗粒的表面引入少量带正电荷的基团，如Fugure5所示，2010年，CSH表面带电杂化颗粒问世，可改善可离子化的分析物的选择性并显著改善碱性化合物的载样量和峰型。
当使用低离子强度流动相条件下（如0.1%甲酸），表面带电杂化颗粒能大大的提升检测灵敏度，很适合分析物在带ESI源的LC-MS方法分析。它的出现，可以使在传统反相固定相保留极差的极性带负电荷的分析物得到保留。它的一项重要应用是碱性肽的分离，例如通过用胰蛋白酶或lys-C酶切蛋白质而产生的碱性肽。
编辑
Fugure5 Preparation of Surface Charged Hybrid Particles from Second Generation Hybrid Particles
04 总结
杂化颗粒集合了高pH稳定性、低硅醇基酸性和高柱效的优点，使之成为了大量不一样分析物分离的首选，通过拓展流动相的pH范围直到超出传统硅胶填料的pH耐受极限，杂化颗粒色谱柱可以在方法开发阶段尝试探索更宽的流动相选择范围，这种扩展可以提供更大的选择性空间，尤其是对于包含pKa值大于8的可电离分析物的混合物而言。它还为碱性分析物提供了更高的柱容量，这在制备色谱上意义重大。
杂化颗粒色谱柱与UPLC密不可分，UPLC可为这些色谱柱的应用提供了快速增长的动力，这些应用包括正相、反相、HILIC和体积排阻排阻色谱，甚至在超临界流体色谱（SFC）上，杂化颗粒色谱柱也有用武之地。随着诸如表面带电杂化颗粒的开发上市，杂化颗粒色谱柱的应用场景范围还将继续扩大，继续为分离科学的发展做出贡献。
05 参考文献
1.Thomas H. Walter. Hybrid Particle Columns: The First Twenty Years. LCGC North America [J]. 37(7):436-442.
2. J.J. Kirkland, M.A. van Straten, and H.A. Claessens, J. Chromatogr. A 691, 3–19 (1995).
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4. C. Hudalla, J. Cook, M. Dion, P. Iraneta, P. Smith, D. Walsh and K. Wyndham, Waters Poster PSTR10126471 (2009).
5.P.C. Iraneta, K.D. Wyndham, D.R. McCabe, and T.H. Walter, Waters White Paper 720003929EN (2011).
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